2021年4月17日訊/生物谷BIOON/---嵌合抗原受體（CAR）T細胞（CAR-T）療法是革命性的，因為它已經產生了非常有效和持久的臨床反應。CAR是一種工程化的合成受體，其功能是重新引導淋巴細胞（最常見的是T細胞）識別和消除表達特定靶抗原的細胞。CAR與細胞表面上表達的靶抗原的結合不依賴于MHC受體，從而導致強有力的T細胞活化和強大的抗腫瘤反應。抗CD19 CAR-T細胞療法治療B細胞惡性腫瘤的空前成功導致它在2017年被美國食品藥品管理局（FDA）批準上市。然而，CAR-T細胞療法仍有重大的局限性必須解決，包括危及生命的CAR-T細胞相關毒性，對實體瘤的療效有限，B細胞惡性腫瘤中的抑制和抵抗性，抗原逃逸，有限的持久性，較差的遷移和腫瘤浸潤，以及免疫抑制性微環境。此外，技術人員必須適應這個不斷增長和發展的領域的需要，為此需要制定教育計劃來培訓他們。

人們已經提出許多方法，包括將CAR-T細胞療法與其他抗癌療法相結合，或采用創新的CAR工程策略，以提高抗腫瘤療效，擴大臨床療效，并限制毒性。在這篇綜述文章中，美國威斯康星大學麥迪遜分校的Robert C. Sterner和梅奧診所的Rosalie M. Sterner討論了CAR-T細胞工程的最新創新，以提高對血液惡性腫瘤和實體瘤的臨床療效，以及克服當前存在的包括抗原逃逸、CAR-T細胞遷移、腫瘤浸潤、免疫抑制性微環境和CAR-T細胞相關毒性在內的局限性的策略（圖1）。

圖1.CAR-T細胞療法的局限性。圖片來自Blood Cancer Journal, 2021, doi:10.1038/s41408-021-00459-7。

CAR結構

CAR是模塊化的合成受體，主要由四個部分組成：(1)一個細胞外靶抗原結合結構域（extracellular target antigen-binding domain）；(2)一個鉸鏈區（hinge region），(3)一個跨膜結構域（transmembrane domain）；(4)一個或多個細胞內信號轉導結構域（intracellular signaling domain）。本文中，這兩名作者將討論目前CAR設計的基本原則。

（1）抗原結合結構域。抗原結合結構域是CAR中賦予靶抗原特異性的部分。歷史上，抗原結合結構域來源于單克隆抗體的可變重鏈（VH）和輕鏈（VL），通一個柔性的連接物連接VH和VL可形成單鏈可變片段（scFv）。通常而言，存在于CAR中的scFv靶向細胞外表面癌癥抗原，導致不依賴于主要組織相容性復合體（MHC）的T細胞活化，盡管使用MHC依賴性的模擬T細胞受體（TCR）的 CAR識別細胞內腫瘤相關抗原已經被描述。除了簡單地識別和結合靶表位之外，scFv的幾個特點影響CAR功能。比如，VH和VL鏈之間的相互作用模式，以及互補性決定區（CDR）的相對位置影響CAR對其靶表位的親和力和特異性。親和力是抗原結合結構域的一個特別重要的參數，因為它從根本上決定了CAR的功能。為了識別腫瘤細胞表面上的抗原、誘導CAR信號轉導并激活T細胞，CAR的抗原結合親和力必須足夠高，但不能高到足以導致CAR-T細胞遭受激活誘導的細胞死亡，并引發毒性。雖然親和力肯定是使問題進一步復雜化的最重要因素之一，但已有研究表明，即使具有相似親和力的scFv也可以差異性地影響CAR-T細胞功能。因此，為了優化CAR與靶抗原的結合，必須考慮其他因素，如表位位置，靶抗原密度，以及避免使用與配體無關的補強信號（tonic signaling）相關的scFv。

抗原結合位點空間示意圖，圖片來自FEBS Journal, 2011, doi:10.1111/j.1742-4658.2011.08207.x。

（2）鉸鏈區。鉸鏈或間隔區被定義為從跨膜結構域延伸結合單元的細胞外結構區域。鉸鏈區的功能是提供靈活性，以克服空間阻礙，并對CAR的長度有貢獻，以便允許抗原結合結構域接觸到靶表位。重要的是，所選擇的鉸鏈區似乎影響CAR的功能，因為鉸鏈區的長度和組成的差異可以影響靈活性、CAR表達、信號轉導、表位識別、激活輸出的強度和表位識別。除了這些影響之外，已經人提出，鉸鏈區長度對于提供足夠的細胞間距離以形成免疫突觸是至關重要的。原則上，“最佳”鉸鏈區長度取決于目標細胞上的靶表位位置和空間阻礙水平：長的鉸鏈區提供增加的靈活性，并允許更有效地接觸到膜近端表位或復雜的糖基化抗原，而短的鉸鏈區更成功地結合膜遠端表位。然而，在實踐中，合適的鉸鏈區長度往往是經驗性確定的，必須為每對特定的抗原結合結構域定制。文獻中有許多例子，比如短間隔CAR[CD19和癌胚抗原（CEA）]和長間隔CAR[粘蛋白1（MUC1），受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1（ROR1）的膜近端表位]。最常用的鉸鏈區來自CD8，CD28，IgG1或IgG4的氨基酸序列。然而，源自IgG的鉸鏈區可以導致CAR-T細胞耗竭，從而降低在體內的持久性，因為它們可以與Fcγ受體相互作用。這些影響可以通過選擇不同的間隔區或通過基于功能或結構的考慮對間隔區進行進一步的改造來避免。

（3）跨膜結構域。在CAR的所有組件中，跨膜結構域可能是最少被表征的區域。跨膜結構域的主要功能是將CAR錨定在T細胞膜上，盡管有證據表明，跨膜結構域也可以與CAR-T細胞功能相關。更具體地說，有研究表明，CAR跨膜結構域影響CAR的表達水平和穩定性，活躍于信號轉導或突觸形成過程中，并與內源性信號分子二聚化。大多數跨膜結構域來自天然蛋白，包括CD3ζ、CD4、CD8α或CD28。不同跨膜結構域對CAR功能的影響沒有得到很好的研究，這是因為跨膜結構域經常根據細胞外間隔區或細胞內信號轉導結構域的要求而改變。

值得注意的是，CD3ζ跨膜結構域可能促進CAR介導的T細胞激活，因為CD3ζ跨膜結構域介導CAR二聚化和整入內源性TCR中。與具有CD28跨膜結構域的CAR相比，CD3ζ跨膜結構域的這些有益影響是以降低CAR穩定性為代價的。跨膜結構域和鉸鏈區似乎也影響CAR-T細胞的細胞因子產生和激活誘導的細胞死亡（AICD），這是因為與具有來自CD28的跨膜結構域和鉸鏈區的CAR相比，具有CD8α跨膜結構域和鉸鏈區的CAR-T細胞釋放的TNF和IFNγ的數量減少，對AICD的敏感性降低。總的來說，有研究表明，將近端胞內結構域與相應的跨膜結構域連接在一起，可能最能促進CAR-T細胞信號的正確傳遞，而使用常用的CD8α或CD28跨膜結構域可能會增強CAR的表達和穩定性。

（4）細胞內信號轉導結構域。可以說，在CAR工程中最受關注的是了解CAR共刺激的效果，目標是生成具有最佳胞內結構域的CAR構建體。在20世紀90年代后期設計出的第一代CAR包含CD3ζ或FcRγ信號轉導結構域。絕大多數CAR依賴于通過CD3ζ衍生性免疫受體酪氨酸激活基序來激活CAR-T細胞。然而，有效的T細胞反應是不能夠僅通過這些激活基序的信號轉導產生。這些第一代CAR的持久性在體外并不強勁。這些發現得到了顯示出有限或沒有療效的臨床研究的呼應。

CC49-ζ 載體圖，圖片來自J Immunother Cancer, 2017, doi:10.1186/s40425-017-0222-9。

使用B細胞惡性腫瘤的早期體內模型證實了共刺激在靶向CD-19的CAR-T細胞持久性方面的重要性。通過添加共刺激結構域，重復抗原暴露后的IL-2產生和細胞增殖得到了改善。隨著對共刺激對持久性CAR-T細胞療法的重要性的理解，人們構建出具有一個與CD3ζ細胞內信號轉導結構域串聯的共刺激結構域的第二代CAR。兩個最常見的獲得FDA批準的共刺激結構域CD28和4-1BB（CD137）都與較高的患者反應率相關。這兩種共刺激結構域的功能和代謝譜不同：具有CD28結構域的CAR-T細胞分化為效應記憶T細胞，主要使用有氧糖酵解，而具有4-1BB結構域的CAR-T細胞分化為中樞記憶T細胞，并顯示出增加的線粒體生物生成和氧化代謝。

臨床上，第二代CAR-T細胞在一些血液惡性腫瘤中產生了強烈的治療反應，包括慢性淋巴細胞白血病、B細胞急性淋巴細胞白血病、彌漫性大B細胞淋巴瘤和多發性骨髓瘤。目前正在研究第二代CAR-T細胞在實體瘤中的療效，包括膠質母細胞瘤、晚期肉瘤、肝轉移瘤以及間皮瘤、卵巢癌和胰腺癌。幾種替代性共刺激結構域，如誘導性T細胞共刺激物（ICOS）、CD27、MYD88、CD40和OX40（CD134）已顯示出臨床前的療效，盡管臨床研究仍有待進行。據推測，僅通過一個結構域的共刺激產生不完全的激活，這導致了第三代CAR的產生。第三代CAR整入兩個與CD3ζ串聯的共刺激結構域。第三代CAR的臨床前研究產生了好壞參半的結果。具體來說，整入CD28和4-1BB信號的CAR在淋巴瘤中導致更強的細胞因子產生，與第二代CAR相比，它們在肺轉移瘤中顯示出更好的體內抗腫瘤反應。在白血病和胰腺癌模型中，第三代CAR沒有顯示出體內治療優勢，并且在各自的模型中未能優于第二代CAR。

CAR-T細胞治療的局限性

（1）抗原逃逸。CAR-T細胞療法最具挑戰性的局限性之一是腫瘤對單抗原靶向CAR（即靶向單抗原的CAR）構建體產生抵抗性。雖然最初的單抗原靶向CAR-T細胞可以提供高反應率，但在接受這些CAR-T細胞治療的患者中，相當一部分患者的惡性細胞表現出部分或完全喪失靶抗原表達。這種現象稱為抗原逃逸。例如，盡管70%～90%的復發和/或難治性ALL患者對CD19靶向CAR-T細胞治療表現出持久的反應，但最近的隨訪數據表明，存在一種常見的疾病抵抗性機制，包括30%～70%的在治療后有復發疾病的患者出現CD19抗原下調/喪失。類似地，在正在接受BCMA靶向CAR-T細胞治療的多發性骨髓瘤患者中，BCMA表達的下調或喪失已被觀察到。類似的抗原逃逸抵抗性模式已在實體瘤中觀察到。比如，靶向膠質母細胞瘤中IL13Ra2的CAR-T細胞治療病例報告表明，腫瘤復發時IL13Ra2表達減少。

為了降低CAR-T細胞治療血液惡性腫瘤和實體瘤的復發率，現在許多策略都依賴于靶向多種抗原。這些策略都采用了雙CAR構建體或串聯CAR的方法，串聯CAR是指含有兩個scFv的單個CAR構建體，以便同時靶向多種腫瘤靶抗原。從臨床上來看，這兩種策略都可能導致長期持久的緩解率，目前已有多項針對CD19和CD20或CD19和CD22的臨床試驗。令人振奮的是，使用雙靶向CAR-T細胞（CD19/CD22或CD19/BCMA）的臨床試驗的初步結果顯示了有希望的結果。更具體地說，CD19/CD22 CAR-T細胞療法的初步臨床試驗結果在ALL和彌漫性大B細胞淋巴瘤成人患者中表現出了良好的療效。此外，BCMA/CD19靶向CAR-T細胞治療多發性骨髓瘤的初步結果表明，BCMA/CD19靶向CAR具有較高的療效和良好的安全性。在實體瘤中，已經在臨床前模型中測試了幾種串聯CAR，包括靶向膠質母細胞瘤中的HER2和IL13Ra2的串聯CAR以及靶向乳腺癌中的HER2和MUC1的串聯CAR。在這兩種情況下，相比于單靶向療法，雙重靶向導致了優越的抗腫瘤反應。在膠質母細胞瘤研究中，與其他兩種雙靶向療法相比，靶向HER2和IL13Ra2的串聯CAR導致抗腫瘤活性改善，抗原逃逸減少。這項研究說明了優化選擇靶抗原的重要性，這不僅可以提高抗腫瘤反應，還可以減少抗原逃逸，防止復發。

（2）非腫瘤組織的在靶效應（On-target off-tumor effects，以下簡稱脫靶效應）。靶向實體瘤抗原的挑戰之一是，實體瘤抗原通常也在正常組織中以不同水平表達。因此，抗原選擇在CAR設計中至關重要，不僅能保證治療效果，還能限制脫靶毒性。克服靶向也存在于正常組織中的實體腫瘤抗原的一個潛在途徑是靶向僅限于腫瘤的翻譯后修飾，如實體瘤過表達的截短O -聚糖，比如Tn（GalNAca1-O-Ser/Thr）和sialyl-Tn（STn）（NeuAca2–6-GalNAca1-O-Ser/Thr）。四個主要的CAR-T細胞靶標已被研究，包括TAG7228，B7-H3，MUC1和MUC16。雖然第一代靶向結直腸癌中TAG72的CAR-T細胞沒有產生抗腫瘤反應，但目前正在研究第二代TAG72-CAR-T細胞的新版本和其他腫瘤限制性翻譯后修飾。為了擴大CAR-T細胞療法在血液惡性腫瘤和實體瘤中的臨床應用，進一步開發創新策略以減少抗原逃逸和選擇能夠誘導足夠的抗腫瘤療效的抗原，同時將毒副作用降到最低將是必要的。

靶向B7-H3的CAR-T細胞，圖片來自Cancer Cell, 2019, doi:10.1016/j.ccell.2019.01.002。

（3）CAR-T細胞的遷移和腫瘤浸潤。與血液惡性腫瘤相比，實體瘤CAR-T細胞治療受限于CAR-T細胞向實體瘤遷移和浸潤的能力，因為免疫抑制性的腫瘤微環境和物理性的腫瘤屏障，如腫瘤基質，限制了CAR-T細胞的滲透和遷移。改善這些局限性的一個策略是利用除全身給送以外的給送途徑，這是因為局部給送（1）消除了CAR-T細胞向疾病部位遷移的需要，（2）限制了脫靶毒性，畢竟CAR-T細胞的在靶活性是針對腫瘤細胞的，從而最大限度地減少它們與正常組織的相互作用。臨床前模型已經證明，在乳腺癌腦轉移和膠質母細胞瘤中，靶向HER2的CAR-T細胞和靶向IL13Ra2的CAR-T細胞的靜脈注射具有卓越的治療效果。這些研究已經導致了三項正在進行的臨床試驗，這三項臨床試驗分別針對膠質母細胞瘤（NCT02208362，NCT03389230）和復發性腦或柔腦膜轉移（NCT03696030）進行CAR-T細胞的靜脈注射。同樣，臨床前模型顯示，通過胸膜內注射CAR-T細胞治療惡性胸膜間皮瘤具有優越性，這已經導致了一項正在進行的1期臨床試驗（NCT02414269）。雖然局部注射似乎有較好的療效，但理論上這種方法僅限于單個腫瘤病灶/寡轉移性疾病（oligometastatic disease）。

最近開發的一種策略似乎可以顯著改善CAR-T細胞的遷移，涉及在CAR-T細胞表面上表達趨化因子受體，以匹配和響應腫瘤源性趨化因子。例如，最近的研究表明，經基因修飾后表達CXCR2的整合素αvβ6-CAR-T細胞或過度表達CXCR1或CXCR2的CAR-T細胞都增強了遷移和顯著提高抗腫瘤療效。腫瘤基質等物理屏障也限制了CAR-T細胞療法，這是因為這些物理屏障阻止了對腫瘤的滲透。腫瘤基質主要由細胞外基質組成，而在細胞外基質中，硫酸肝素蛋白聚糖（HSPG）是CAR-T細胞必須降解從而進入腫瘤的主要成分。經過基因改造后表達降解HSPG的乙酰肝素酶（heparanase）的CAR-T細胞顯示出增強的腫瘤浸潤和抗腫瘤活性。同樣，靶向成纖維細胞活化蛋白（FAP）的CAR-T細胞在動物模型中通過減少腫瘤成纖維細胞表現出增加的細胞毒性功能。在未來，有必要開發創新的遞送策略和方法，以提高腫瘤滲透，以便將治療效果擴大到復雜的實體瘤和轉移瘤。

（4）免疫抑制性微環境。在腫瘤微環境中，許多驅動免疫抑制的細胞類型可以浸潤實體瘤，包括骨髓源性抑制細胞（MDSC）、腫瘤相關巨噬細胞（TAM）和調節性T細胞（Treg）。這些腫瘤浸潤細胞驅動腫瘤促進細胞因子、趨化因子和生長因子的產生。此外，免疫檢查點途徑，如PD-1或CTLA-4，可用于降低抗腫瘤免疫。對CAR-T細胞治療無反應或反應較弱的主要原因之一是T細胞擴增較差和T細胞的短期持續存在。據推測，這種T細胞功能衰竭的產生由共同抑制途徑觸發。因此，CAR-T細胞和免疫檢查點阻斷的聯合免疫治療被認為是下一個免疫治療的前沿，因為它提供了強大免疫反應所必需的兩個要素：（1）浸潤腫瘤的CAR-T細胞；（2）PD-1/PD-L1阻斷，可確保維持T細胞的持久性和功能。在血液惡性腫瘤中，在賓州兒童醫院的一項單中心研究中，對14名事先接受大量治療的B-ALL兒童進行PD-1阻斷和CD19 CAR-T細胞聯合治療，改善了CAR-T細胞的持久性和實現了更好的臨床結果。在實體瘤中，目前有許多研究旨在評估這類聯合治療的反應率。在一項耐人尋味的研究中，11名間皮瘤患者在接受環磷酰胺預處理后，再接受單劑量的間皮素靶向CAR-T細胞和至少三劑抗PD-1藥物，結果實現72%的反應率和兩名患者的完全代謝反應。結合其他形式的免疫治療策略可能仍然是必要的，以便對抗存在于腫瘤微環境中的抑制信號。

最近的研究工作集中在對不友好的腫瘤微環境中的免疫抑制因子（比如TGF β介導的抑制信號）有抵抗力的CAR基因改造上。另一個有趣的策略涉及對CAR-T細胞進行基因改造，以刺激性細胞因子的形式提供免疫刺激信號，增加T細胞的生存、增殖、抗腫瘤活性，并重新平衡腫瘤微環境。許多研究已經探究了許多細胞因子來創建這些“裝甲CAR（armored CAR）”。關注促炎細胞因子的表達而不是關注抑制信號的研究依賴于IL-12分泌、IL-15表達，以及將免疫抑制性細胞因子（如IL-4）信號重新引向促炎細胞因子。

雖然免疫檢查點阻斷-CAR-T細胞聯合療法很可能是一種新的免疫治療選擇，但也要認識到，即使這種組合可能仍然不足以誘導T細胞的浸潤和效應功能。因此，將CAR-T細胞療法和免疫檢查點阻斷與其他免疫療法/策略相結合的額外研究可能是實現T細胞在復雜血液惡性腫瘤或實體瘤中的浸潤和效應功能所必需的。

（5）CAR-T細胞相關毒性。雖然CAR-T細胞療法已經是一種革命性的癌癥治療工具，但較高的毒副作用率與一些死亡阻止了CAR-T細胞療法成為一線治療。可能決定細胞因子釋放綜合征（CRS）、嗜血細胞綜合征（HLH）/巨噬細胞活化綜合征（MAS）和/或免疫效應細胞相關神經毒性綜合征（ICANS）發生率和嚴重程度的關鍵因素是CAR的設計、特定靶點和腫瘤類型。到目前為止，CAR-T細胞療法的毒性已經在接受獲得FDA批準的第一個CAR-T細胞療法---靶向CD19的CAR-T細胞---的患者中得到了最廣泛的描述。即使在反應率最高的臨床試驗中，患者也會發生嚴重的危及生命的事件。具體來說，在急性淋巴細胞白血病/淋巴瘤（ALL/LBL）患者接受CAR-T細胞治療的情況下，幾乎所有的患者都有至少一些不太嚴重的毒性表現，而23%～46%的患者表現出嚴重的超生理細胞因子的產生和大量的體內T細胞增殖。這些毒性水平的全身細胞因子釋放和部分患者出現的嚴重的免疫細胞交叉激活導致以下毒性：（1）CRS，它與超生理細胞因子的產生和大量體內T細胞增殖有關；（2）HLH/MAS，它被定義為一種嚴重的高炎癥綜合征，其特征是CRS、血清鐵蛋白升高和噬血細胞增多、腎功能衰竭、肝酶、脾腫大、肺水腫和/或自然殺傷（NK）細胞活性缺失；（3）ICANS，其特征是腦脊液細胞因子水平升高和血腦屏障破壞。

從機制上講，CRS是由于給送的CAR-T細胞被廣泛激活，導致大量細胞因子的釋放。輕度CRS的臨床表現是發熱，伴有疲乏、腹瀉、頭痛、皮疹、關節痛和肌痛，在更嚴重的情況下，患者可能會出現低血壓、心臟功能障礙、循環衰竭、呼吸衰竭、腎功能衰竭、多器官系統衰竭，并有可能進展到死亡。總的來說，77%～93%的接受CAR-T細胞治療的白血病患者和37%～93%的接受CAR-T細胞治療的淋巴瘤患者有任何一種級別的CRS，而用tisagenlecleucel治療復發/難治性B-ALL的患者中46%的人和用axicabtagene ciloleucel和tisagenlecleucel治療彌漫性大B細胞淋巴瘤的患者中13%～18%的人表現出≥3級CRS。在病理生理學上，CRS被認為主要是由IL-6介導的，因此，CRS管理依賴于使用托珠單抗和皮質類固醇來阻斷IL-6受體。即使使用FDA批準用來治療重度CRS的托珠單抗，重度CRS和死亡仍然發生。

有趣的是，CAR-T細胞治療后的HLH/MAS對IL-6抑制產生抵抗性，可能需要化療。雖然由于與高級別CRS重疊，CAR-T細胞治療后的HLH/MAS發生率尚不清楚，但在大約1%的接受CAR-T細胞治療的患者中已有報道。在神經毒性的情況下，潛在的病理生理學和機制尚不完全清楚。ICANS的臨床表現范圍從精神錯亂、頭痛、注意力障礙、尋字困難、局灶性神經功能障礙或腦病到危及生命的腦水腫、短暫性昏迷或癲癇發作。CAR-T細胞治療后的神經毒性相對較為常見，在接受治療的白血病患者和淋巴瘤患者中，分別有高達67%和62%的人發生神經毒性。對神經毒性的管理集中在皮質類固醇，因為IL-6抑制劑通常對CAR-T細胞治療相關的神經毒性無效。到目前為止，仍然沒有批準的療法來預防上述毒性，這就使得優化CAR設計和采用其他策略來減少CAR誘導的毒性至關重要。下面，這些作者回顧了在CAR設計中的經驗教訓以減少毒性，以及采取的額外策略，以緩解CAR-T細胞療法中的毒性。

針對CAR-T細胞的局限性采取的應對策略

為了達到有效的治療反應，CAR-T細胞的抗原結合結構域必須結合它的靶表位，并達到最低閾值水平，以誘導CAR-T細胞激活和細胞因子分泌。但與此同時，也存在一定的激活閾值水平，當超過該閾值水平時，會產生毒性水平的細胞因子和免疫系統激活。換句話說，CAR-T細胞必須保持在其治療窗口內才能發揮臨床療效，因為超過治療窗口將導致毒性。從基因改造的角度來看，CAR-T細胞的激活程度和激活動力學受到幾個因素的影響，包括但不限于惡性細胞表面上表達的腫瘤抗原的水平，腫瘤負荷，抗原結合結構域對其靶表位的親和力，以及CAR的共刺激結構域。因此，在優化治療效果和限制毒性方面，仔細考慮CAR的模塊化結構的幾個組成部分是必要的。

（1）改變CAR結構。降低毒性的一個途徑是通過改變CAR-T細胞的抗原結合結構域的親和力。降低抗原結合結構域的親和力預計將導致對腫瘤細胞表面上更高的抗原密度的要求增加，以實現高水平的激活。因此，預計下降的抗原親和力將規避對具有相對較低抗原量的健康組織的靶向。探究這一原理的研究表明，與具有低納摩爾/亞納摩爾親和力的抗原結合結構域相比，具有微摩爾親和力的抗原結合結構域對具有較高水平的靶抗原表達的腫瘤的選擇性要高得多。

人們也有可能通過通過修飾活化的CAR-T細胞的鉸鏈區和跨膜區來調節細胞因子分泌。例如，在靶向CD19的CAR中，修飾CD8-α衍生的鉸鏈區和跨膜區氨基酸序列可導致細胞因子釋放水平降低，CAR-T細胞增殖減少。優化鉸鏈區和跨膜區可能是一個有用的方法來降低毒性，因為在1期臨床試驗中，這些在鉸鏈區和跨膜區發生修飾的CAR導致54.5％的B細胞淋巴瘤患者（6/11名患者）完全緩解，重要的是，沒有級別>1的CRS或ICANS事件發生。

共刺激結構域在CAR設計中提供了另一個可修飾的區域，該區域可以根據腫瘤類型、腫瘤負荷、抗原密度、靶抗原-抗原結合結構域對以及潛在的毒副作用進行定制。具體來說，4-1BB結構域導致較低的毒性風險，較高的T細胞耐久性，以及較低的T細胞增殖峰值水平，而CD28共刺激結構域與CAR-T細胞活性有關，該活性的起始和隨后的衰竭更為迅速。因此，產生較小毒性的4-1BB共刺激結構域在高疾病負擔和/或高抗原密度的腫瘤的情況下可能特別有用，而CD28共刺激結構域可能是在總表面抗原密度較低和/或具有低親和力抗原結合結構域的CAR的情況下達到所需的T細胞活化閾值所需要的。

（2）降低免疫原性。宿主免疫系統對CAR構建體的識別可能促進細胞因子相關的毒性，因此，利用人類或人源化抗體片段代替鼠源CAR來降低CAR的免疫原性可能是有利的。此外，鉸鏈區和/或跨膜結構域可以被修改，以降低CAR的免疫原性，而且有趣的是，CAR-T細胞的持久性得到改善。

（3）修改CAR轉導的T細胞，降低神經毒性。一個令人興奮的最近開發的防止CAR-T細胞細胞因子毒性的途徑是基于對CAR轉導的T細胞進行修飾。細胞因子和髓樣細胞似乎在CAR-T細胞誘導的神經毒性中起著重要作用，因為有報道顯示，在3級或更高的神經毒性患者中CD14+細胞顯著增加，而且一項關鍵的針對大B細胞淋巴瘤的CAR-T細胞臨床試驗表明，在與3級或更高的神經毒性產生相關的血清生物標志物中，GM-CSF升高與神經毒性最顯著相關。最近的臨床前研究表明，在用lenzilumab抑制活化巨噬細胞和單核細胞的細胞因子GM-CSF后，神經毒性和CRS減少，CAR-T細胞活性增加。GM-CSF突變失活在CAR轉導的T細胞中似乎也有類似的效果。

因此，這些研究結果表明，GM-CSF中和有助于減少神經毒性和減少CRS。此外，以髓樣細胞特異性的方式剔除酪氨酸羥化酶或使用甲酪氨酸抑制這種酶，導致兒茶酚胺和細胞因子水平下降。臨床前證據還表明，IL-1受體拮抗劑減少了用靶向CD19的CAR-T細胞治療的白血病/淋巴瘤小鼠模型中的一種神經炎癥形式。

（4）CAR“關閉開關”。緩解CAR-T細胞毒性的另一個潛在途徑是通過實施“關閉開關”或自殺基因策略。這樣的策略將有助于在不良事件發生時通過二級誘導劑處理選擇性減少經過基因改造的細胞。利用這些概念的幾種方法已被開發。比如，獨立表達全長CD20或CD20模擬表位或經過基因改造后表達全長CD20或CD20模擬表位的CAR構建體促進通過利妥昔單抗處理剔除CAR-T細胞。然而，這種方法的一個局限性是抗體介導的CAR-T細胞剔除的相對緩慢的發生，這可能會限制這種方法在嚴重的急性細胞因子介導的毒性期間需要立即逆轉這種毒性的患者中的療效。這促使人們開發出更快的開關，如誘導性cas9。在一項臨床試驗中，誘導性cas9在30分鐘內消除了90%以上經過基因改造的T細胞。

其他策略依賴于基于蛋白酶的小分子輔助關閉CAR（SMASh-CAR），這也被稱為關閉開關CAR（SWIFF-CAR）。自殺策略或其他類似方法的最大局限性是，盡管它們對確保安全性很有吸引力，但它們的使用會突然停止對快速進展的疾病的治療。這一限制已經成為一種強大的動機，促使人們制定策略來確保安全性，而自殺基因激活則是最后的手段。一種具有令人興奮的潛力的方法涉及使用酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼，其功能是通過抑制近端TCR信號激酶來抑制T細胞的激活。在臨床前模型中，達沙替尼快速且可逆地阻止CAR-T細胞的激活，并且在CAR-T細胞輸注后早期給予達沙替尼的結果是顯著降低小鼠因致命性CRS出現的死亡率。因此，這種方法似乎提供了對CAR-T細胞功能的暫時性抑制，并且可以允許在毒性消退后挽救CAR-T細胞療法。未來，開發暫時抑制CAR-T細胞功能并在毒性消退后允許CAR-T細胞療法挽救的額外創新方法將是CAR-T細胞治療邁向血液惡性腫瘤和實體瘤一線治療的必要條件。

結論

CAR是一種模塊化的合成受體，主要由四個部分組成：一個細胞外靶抗原結合結構域、一個鉸鏈區、一個跨膜結構域和一個或多個細胞內信號轉導結構域。CAR-T細胞已經徹底改變了某些血液惡性腫瘤的治療。然而，仍然存在障礙。對技術人員進行培訓使之滿足這個復雜和不斷發展的領域的需求是具有挑戰性的，需要開發創新的課程。抗原選擇對CAR-T細胞功能至關重要。由于CAR-T細胞的選擇性壓力，腫瘤細胞可以下調抗原表達。即使有適當的抗原靶向，脫靶效應也會發生，并引起相關的毒性。在實體瘤中，讓CAR-T細胞遷移到腫瘤并浸潤腫瘤是一大挑戰。惡性腫瘤的免疫抑制性微環境會加劇這一障礙。有效的治療也會導致CAR-T細胞相關毒性（比如CRS和神經毒性）的風險。然而，雖然存在挑戰，但新的策略和潛在的解決方案仍在不斷發展，并且可能為未來更有效和更安全的治療提供一條道路。（生物谷 Bioon.com）

參考資料：

Robert C. Sterner et al. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer Journal, 2021, doi:10.1038/s41408-021-00459-7.